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    wb实验常见诊断报告和优化方案

    2019年08月08日 13:56   生物.医药.天然产物

    爱必信(上海)生物科技有限公司 发布 访问商铺

    关键字:wb实验

    实验案例1:泳道高背景

    问题分析:多条带以及高背景集中在泳道上,大概率是样本时间太久,或者蛋白酶抑制剂没加发生了蛋白降解,或者是组织样本中,成分太复杂,加上抗体特异性一般造成的。

    问题诊断

    1. 1. 样本时间太久
    2. 2. 组织样本背景高
    3. 3. 蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂没有加

    建议方案

    新鲜制备样本,加入蛋白酶抑制剂。对于组织样本,要求超声。对于特异性一般的抗体,先用细胞样本做下。

      

    实验案例2:全膜高背景

    问题分析:像这种全膜的高背景,大概率是缓冲液的问题??梢蕴岣叻獗找号ǘ群头獗帐奔?,抗体稀释液使用5%脱脂牛奶或者根据说明书要求来,洗涤的TBST增加nacl浓度以及吐温浓度,增加洗涤的次数和时间。

    问题诊断

    1. 1. 封闭液
    2. 2. 抗体稀释液
    3. 3. 洗涤

    建议方案

    封闭液使用5%脱脂牛奶(新鲜配置),4度封闭过夜??固逑∈鸵菏褂?%脱脂牛奶,TBST中nacl浓度增加至500mM,吐温增加至0.5%,洗涤15min*3次或者10min*4次。

    PS:这个case客户本来使用1%BSA稀释抗体,换用5%BSA,背景就没问题了

      

    实验案例3:全膜高背景

    问题分析:排除二抗非特异性,就是不加一抗,直接加二抗孵育,看是否有非特异性条带,对于一般客户来说,更换二抗是更加简便的方法。(能拿结果,不仅仅验证),二抗稀释液强烈推荐5%脱脂牛奶,如果前两者都无法改善结果,考虑一抗非特异性。

    问题诊断

    1. 1. 二抗非特异性
    2. 2. 抗体稀释液
    3. 3. 一抗非特异性

    建议方案

    更换二抗,排除二抗非特异西,二抗稀释液使用5%脱脂牛奶,更换一抗。

    更换二抗后【如左图】

      

    实验案例4:高背景、杂带

    问题分析:全膜的背景问题,主要是一抗二抗未洗涤干净,基本残留在膜上。

    问题诊断

    1. 1. 洗涤不充分

    建议方案

    TBST中nacl浓度增加至500mM,吐温增加至0.5%,洗涤15min*3次或者10min*4次

    优化后结果【如左图】

      

    实验案例5:条带过粗、杂带

    问题分析:条带过于粗往往是因为样本上样量太高,一抗浓度高,加上曝光时间久。

    问题诊断

    1. 1. 样本信号太强
    2. 2. 杂带多
    3. 3. 曝光时间太久

    建议方案

    减少上样量,减少一抗浓度,减少曝光时间。

    优化后结果【如左图】

      

    实验案例6:不出带

    问题分析:一般没条带的主要关注样本表达量,文献或者看上下游蛋白结果,如果是磷酸化的,还要看上下游的磷酸化。对于大分子量(150KD以上)或者小分子蛋白(小于20KD),看下丽春红染色,确认转膜效率??固迮ǘ群推毓馐奔浒镏銮啃藕?。

    问题诊断

    1. 1. 样本表达量和处理方式
    2. 2. 转膜
    3. 3. 抗体浓度
    4. 4. 曝光时间

    建议方案

    增加上样量,使用合适的刺激处理方式,增加阳性对照,增加一抗浓度,增加曝光时间。


    爱必信特色产品线(全部现货):

    二抗、标签抗体、对照抗体;WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;细胞因子、信号通路调节剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒、呼吸爆发试剂盒;动植物提取物...

     

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